フィーダー細胞のストック作製とその使用方法

（ストックの作製）

１）あらかじめ、解剖はさみ、ピンセット、駒込ピペット、ニップルを滅菌しておく。また、0.1％トリプシン（ＥＤＴＡ-ＰＢＳ）を３７度ＣＯ２インキュベーター内で暖めておく。
２）妊娠１４日目のマウスを頸椎脱臼し、７０％エタノールに浸す。
（以下の作業はクリーンベンチ内で）
３）ＰＢＳ（ー）１０ｍｌをいれた１０ｃｍディッシュを３枚用意する。
４）胎仔を子宮ごと取り出し、１枚目のディッシュに入れて洗う。
５）２枚目のディッシュに移し、子宮から胎児を取り出す。
６）取り出した胎仔を３枚目のディッシュに移し、内蔵をできるだけ取り除く。
７）内蔵を取り出した胎仔を別のディッシュに移し、はさみでなるべく細かく切り刻む。
８）0.1％トリプシンを加え（胎仔５匹あたり２０ｍｌ）、５０ｍｌチューブに移し２０分間ゆっくり撹拌する。
９）駒込ピペットでピペッティング。
１０）同量のの0.1％トリプシンを加え、さらに２０分間ゆっくりと撹拌する。
１１）ＤＭＥＭ・１０％ＦＣＳをトリプシン液と当量加え、駒込ピペットでピペッティングする。
１２）しばらく静置し、残渣が沈んだら上澄みを５０ｍｌチューブに移す。
１３）遠心する（１０００ｒｐｍ．５分）。
１４）ＤＭＥＭ・１０％ＦＣＳ（胎仔５匹あたり４０ｍｌ）で懸濁し、細胞数を数える（トリパンブルー使用）。
１５）１０ｃｍディッシュ一枚あたり１Ｘ１０＾７でまく。
１６）コンフルエントになったら凍結（一本５Ｘ１０＾６）し、これをフィーダーのストックとする。

（解凍）

１）凍結ストックされたチューブ１本をぬるま湯でとかし、50 ml チューブに4 ml 10% FCS-DMEM と合一して 1000 rpm, 5 min 遠心する。

２）上清を除去し、50 ml 10% FCS-DMEM に懸濁して（ピペッティング厳禁） 10 ml/100 mm dish ずつ５枚にまく。３日目位でコンフルエントになる。必ずコンフルエントに達した後 feeder layer を作製する。

（フィーダーの作製）

試薬
＊X 100 マイトマイシン C 液
SIGAM No. M-0503 2 mg のバイアルに滅菌水を 2 ml 加え、フィルター
滅菌する。250 ml ずつ分注し、-80ﾟC 保存。
＊10% FCS-DMEM
＊0.1% gelatin
SIGMAの No. G-2500 を 0.1% となるように純水に加え、オートクレ
ーブする。室温保存。
＊EDTA-PBS
＊0.1% トリプシン／EDTA-PBS
2.5% トリプシン原液を希釈する。冷蔵保存。１週間くらいで使いきる。

方法
１）作製前日培地交換。

２）当日培地を一部除き、5 ml とする。X 100 マイトマイシン液を 50 ml 加え、軽くゆすって完全に混合させる。

３）２時間以上培養する。フィーダーを作製する dish や plate に 0.1% gelatin を底面が覆う程度入れ、インキュベーター内に入れておく。この状態で使用するまで何日でもほっといていい。乾いてしまってもよい。（ただしカビ等のコンタミをチェックすること）。２時間以上インキュベートすること。

４）細胞の培地を除去し、10 ml EDTA-PBS で洗浄する。1 ml 0.1% トリプシン／EDTA-PBS を加え、インキュベーター中で５分間おく。この間にゼラチン液を除去し、培地を底面が覆うくらい入れておく。

５）インキュベーターより取り出し、ゆすって細胞を底面より遊離させる。

６）4 ml 培地を加え、50 ml チューブにうつす。５枚の dish の細胞を合一する。一部とって細胞数をカウントする。

７）1000 rpm, 5 min 遠心する。

８）2 X 10^5 cells/ml になるように懸濁し（フィーダー細胞はピペッティングに非常に弱い。できるだけ緩やかに懸濁する）、ゼラチンコートした dish などから培地を除去した後、以下の容量でまく。大体５枚の 100 mm dish から 100 ml 位の細胞懸濁液ができる。
60 mm 　　　5 ml
6-well plate 2.5 ml
24-well plate 0.5 ml

９）５、６時間後より使用可。１週間以内に使用する。作製後３日目以降に使用するときは前日に培地交換して、細胞を元気にしておく。