ＥＳ細胞の培養、培地の作製、サブカルチャー、凍結

　ＥＳ細胞の培養の注意点の一つは培養しすぎに注意すること。通常、継代後７２時間放置することはない。４８時間後には継代をおこなうようにする。速い分には２４時間後でもかまわない。コンフルエント前の最後の数時間というのはＥＳ細胞の数、コロニーの形態等が急激に変化するので、注意深い観察が必要。あと半日くらいは大丈夫だろうとおもって家に帰って寝てしまうと、次の日、ＥＳ細胞の様子は激変してしまう。逆に継代してしばらくは分裂も遅く、培地交換はさほど神経を使う必要はない。
　もう一つの注意点は、逆に継代のやり過ぎである。ＥＳ細胞は培養環境で生きていく限り要らない遺伝子がたくさんあるわけで、そういった遺伝子がいつ抜け落ちとも限らない。極端な話、染色体がひとつ脱落しても見かけ上、区別のつかないときすらある。逆に染色体が多くなると分裂速度が増し、ワイルドタイプのＥＳ細胞より有利なためこれが生じると非常にやっかい。この様なＥＳ細胞は当然ながらジャームラインに落ちる能力はほとんどない。ＥＳ細胞のマウス一個体を発生させる能力はむしろ奇跡的能力なのであって、その点は十分注意を要する。エレクトロポレーションに使用するＥＳ細胞は特に大量に同世代で凍結保存しておくことが必要である。

（１）ＥＳ用培地 (ＥＳＭ) の作製
（試薬）
＊DMEM (high glucose)(炭酸水素ナトリウム3.7g・１ＮのHCl を７から８ml)：フィルター濾過して冷蔵保存。
＊FCS ：ロットチェックしたもの。一度溶かしたら冷蔵保存しておく。
＊X 100 sodium pyruvate (GIBCO)　冷蔵保存。
＊X 100 non-essential amino acids (GIBCO)　冷蔵保存。
＊X 10000 LIF
ESGRO 製、和光純薬販売1ml を２２ul ずつに分注して-80度保存。一度融解したら２度と凍結はおこなわないこと。
＊X 1000 2-mercaptoethanol (SIGMA, M3148)
1 ml DW に 7 ul 2-ME を加え、フィルター濾過して -80ﾟC 保存。古いものは使用しない。

（作り方）
以下のように混合する。一度に 200 ml ずつ作り、１週間程度で使いきる。pH が上昇して赤変したものは使用しない。使用前に３７度で１０分以上あたためる。

DMEM 156 ml
FCS 40 ml
X １００ sodium pyruvate 2 ml
X １００ NEAA 2 ml
X １００００ LIF ２２ ul
X １０００ 2-ME ２００ ul
Total ２００ ml

（２）サブカルチャー
（用意するもの）
＊ESM
＊Feeder layer
＊0.25% trypsin/EDTA-PBS
＊EDTA-PBS

（方法）
１）培地を除き、EDTA-PBSで一回洗浄する。トリプシン液を 1 ml/60 mm dish くわえ、インキュベーター中で５分間置く。
２）dish をゆすり底面より細胞を遊離させる。
３）培地を 4 ml 加え、ピペッティングを十分して（１０回以上吸ったりはいたりする）細胞の凝集が無い状態にする。ES細胞は小さな球状をしており、丈夫で、この操作で壊れたりしない。枚数が多いときは５、６枚くらいを１セットにして行う。ピペッティングまでに時間がかかると細胞の凝集が起こってしまﾜう。
４）遠心チューブにうつす。一部とって細胞数を測定する。丸く光っている細胞のみを数える。60 mm コンフルエントで 1 X 10^7 cells の細胞がいる。
５）1 X 10^6 cells/60 mm dish となるように新しい dish にまく。培地量 5 ml とする。
６）翌日より毎日培地交換する。

（３）凍結
（必要なのも）
＊10% DMSO/ESM
＊凍結するための発泡スチロール

（方法）
１）サブカルチャー１）ー４）を行う。
２）1000 rpm, 5 min 遠心する。
３）上清を除き、5 X 10^6 cells/ml となるように 10% DMSO/ESM に懸濁する。
４）1 ml ずつクライオチューブに分注し、発泡スチロールの容器に入れ、-80ﾟC 一晩置く。
５）翌日からは、液体窒素中に保存する。