エレクトロポレーション

（用意するもの）
＊ＥＳ細胞：
　１セット １ X １０^７ (培養１日から２日目のもので、５０％から７０％コンフルエントくらいのものが望ましい。 ６０ｍｍ培養皿で ５、６枚程度。エレクトロポレーションをかけるＥＳ細胞は培養４８時間くらいのものを用いること。コンフルエントにまでもっていった物を使用してはいけない。培養４８時間たった時点でもエレクトロポレーションに細胞数が足りないと判断したら、そこで継代をおこない後日改めてエレクトロポレーションをする。

＊ターゲッティングベクター：
　ＱＩＡＧＥＮで精製した物を使用する。必ず制限酵素によって直線化をおこない、フェノール抽出後、エタノール沈殿をおこなう。エタノール洗浄は入念におこなう。下記ＨＢＳで６００ng/ml とし、１セット １００ul 使用する。例えば、１０ｋｂのターゲッティングベクターの場合だと６０ug、１５ｋｂだと９０ug使用することになる。
　なお、ターゲッティングベクターが２０ｋｂくらいに長くなってくると通常のラージプレップ培養では効率よくベクターを回収できない時がある。あるいは妙に短い形のベクターに変質してしまうこともある。これは長いベクターがくみこまれた大腸菌の増殖速度が遅いためと考えられる。このときは培養温度を少し下げる（３０度）。同時にアンピシリン濃度を２倍くらいに上げ、増殖速度を押さえる。この場合でも、増殖させすぎは禁物である。

＊G418 耐性 フィーダー細胞；１セット ６０ｍｍ培養皿 ７枚程度。

＊ＥＳＭ

＊ＨＢＳ final conc.
Hepes 1 g 25 mM
NaCl 1.6 g 137 mM
KCl 74 mg 5 mM
Na2HPO4-12H2O 50 mg 0.7 mM
Glucose 0.2 g 6 mM
DWに溶解し pH7.05 に合わせた後、全量を 200 ml とする。濾過滅菌。室温保存。

＊Gene pulser 用キュベット

＊X 100 G418 (GIBCO) ; net weight １５ mg/ml in 滅菌水。 濾過滅菌、冷蔵保存。

＊G418-ESM：ESMにG418を１／１００量加える。

（方法）
１）エレクトロポレーション前２ー３時間に培地交換する。
２）ＥＳ細胞の培地を除き、EDTA-PBS ５ ml で一度洗浄。1 ml トリプシン液を加え、インキュベーター中５分間置く。
３）培養皿をゆすり、細胞を底面から遊離させる。
４）ESMを 4 ml/dish 加え、軽く揺すって混合させる。Ｐ１０００ピペットマンでよくピペッティングして細胞を single cell にする。single cell になっていないと効率が減少する。
５）50 ml 遠心管に集めて 1000 rpm, 5 min 遠心する。
６）冷ＨＢＳ 10 ml に細胞を懸濁し、一部をとって細胞数を数える。
７）１０００ｒｐｍ、五分間遠心する。
８）１X １０^7 cells/0.4ml となるように冷ＨＢＳで懸濁し、細胞液 0.4 ml とDNA溶液 0.1 ml をキュベットに入れて混合する。氷冷下で１０分。
９）0.25 V, 950-975uFD, 抵抗無限（Gene pulser II, BIORAD）でエレクトロポレーションする。エレクトロポレーションの条件はいろいろあるが、これをいじると他のパラメーターにも影響が出るので基本的にはいじらない。終了後のパルス時間は４０から４５ミリ秒前後の値になる。
１０）室温１０分間放置。
１１）３５ー４０ ml ESM に懸濁し、5 ml ずつ G418 耐性 feeder の上にまく。
１２）３６時間後にG418-ESMで培地交換する。それまではそっとしておく。
１３）以降毎日培地交換する。細胞が死に始めるまでは培地が半日程度で黄色くなってしまうこともあるので、そのときは半日で培地交換を行う。死んだ細胞を除くため、培地交換の前に軽く培養皿をゆする。細胞がほとんど死んでしまったら培地交換は２日に一回にする。
１４）約１週間でピックアップできるコロニーが生えてくる。