ＥＳ細胞コロニーピックアップ

　ＥＳ細胞のコロニーが適当な大きさになるのを見計らってピックアップをおこなう。ピックアップに適した期間はＥＳ細胞の特性上、当然短いので注意が必要。１日ずれると様相ががらりと変わってしまう。目安は２００まいくろチップの尖端の半分くらいの大きさ。つやつやしていて形のいいものだけを選択的にひらう。すそ野の広がったコロニーは絶対に避ける。また、妙に小さいコロニーはネオ耐性遺伝子が入っていないことが可能性があり、ひらわない。逆に、大きなコロニーも染色体異常を起こしている可能性があるので避ける。一日のピックアップでは１００個から１５０個くらいが限界。ＥＳ細胞はエレクトロポレーション後、７日目から１０日目くらいに生えてくるので、２日に分けてピックアップする。例えば、７日目と９日目、あるいは８日目と１０日目。無論、３日間連続して毎日ピックアップするのもいい。

（用意するもの）
＊フィーダー細胞（９６穴プレート）：ＥＳＭに培地交換しておく。１０ｍＬピペットで１穴あたり１滴加える。
＊顕微鏡をアルコール消毒してクリーンベンチ内に入れておく。
＊滅菌乾燥済み２０、２００μｌチップ
＊９６穴プレート
＊ＥＳＭ
＊ＰＢＳ（ー）
＊0.25％トリプシン・ＥＤＴＡ−ＰＢＳ

（方法）
１）培地をＰＢＳ（ー）に交換する。

２）２０μｌピペットマンを５μｌにあわせて、顕微鏡を見ながらチップの先でコロニーをちょんちょんと何度かつつき、コロニーがプラプラと遊離し始めたらチップの先をコロニーに押しつけて一気に吸い取る。コロニーが跡地に残ってないかどうか確認。

３）９６穴プレートに移す。乾燥をふせぐため、毎回ふたは必ず閉める。

４）この操作を１２回（以内）行い、これを１ラウンドとする。

５）ピックアップを一通り終了したＥＳ細胞培養皿は、ＰＢＳ（−）を、ＥＳＭに交換して、ＣＯ２インキュベーターに戻しておき、次回のピックアップまで放置。

６）９６穴の各穴にトリプシン液を５μｌずつ入れＣＯ２インキュベーターで５分。

７）９６穴の各穴に１０ｍＬピペットでＥＭＳを２滴ずつ加え、２００マイクロチップで１５回程度ピペッティングを行い、あらかじめＥＳＭを１滴ずつ入れてある９６穴フィーダープレートに移す。

８）１ラウンド分の操作終了後、９６穴フィーダープレートはインキュベーター内に入れる。

９）以上の操作を繰り返し、すべてのコロニーをピックアップする。

１０）できれば半日後に培地交換。できなければ２４時間以内に培地交換。

１１）９６穴プレートが６０％以上のコンフルエントになったら半分を２４穴プレートで凍結、半分をゼラチンコートした２４穴プレートに移す。これがコンフルエント（培養液が黄色くなる）になったらゲノムＤＮＡを抽出する。

（９６穴でのＥＳ細胞凍結）
１）同一の番号を書き入れた空の２４穴プレートとゼラチンコートした２４穴を用意する。それぞれ０・５ｍｌずつの２０％ＦＣＳ／ＤＭＥＭを加えておく。

２）９６穴プレートの２４穴分をＰＢＳ（−）で２回洗う。

３）１０ｍｌピペットで１滴ずつ０・２５％トリプシン溶液を加える。プレートをとんとんとたたいて溶液を撹拌する。

４）３７度、５分。

５）１０ｍｌピペットで２滴ずつ２０％ＦＣＳ／ＤＭＥＭを加える。まずは１２穴分だけ。

６）１０回程度２００μｌピペットマンでピペッティングし、１００μｌを凍結プレートへ、残りをゼラチンプレートへ。これを１２穴分繰り返した後に、残りの１２穴も同じ処理をする。ゼラチンプレートはインキュベーターへ。

７）凍結プレートにＤＭＥＭを５５μｌ加える。
８）プレートを回転させて溶液をよく混ぜる。

９）ビニールテープでシールして、発泡スチロール容器のなかへいれて、ー８０度のディープフリーザーへ。このまま１カ月くらいは保存可能。その間にスクリーニングを終わらせる。

１０）これをすべての９６穴に対して行う。