ＥＳ細胞からのゲノムＤＮＡ調製

（用意するもの）
＊ＴＮＥ (for 100 ml)。オートクレーブ後、 冷蔵保存。
1 M Tris (pH 7.5) 2 ml (final 20 mM)
3 M NaCl 5 ml (150 mM)
250 mM EDTA 400 ul (1 mM)
SQ 92.6 ml
＊１０％ ＳＤＳ
＊ＴＮＥ／ＳＤＳ（ＴＮＥ８ｍｌに１０％ＳＤＳを１００ｕｌの割合で加えたもの）
＊10 mg/ml Proteinase K in 50% glycerol: -20ﾟC 保存
＊PhOH/Ch/Iso
＊EtOH, 70% EtOH

（方法）
１）24穴で60％以上コンフルエントになったのＥＳ細胞の培地を引き抜き、ＰＢＳ（ー）で１回洗浄する。

２）0.4 ml のＴＮＥ／ＳＤＳを加え、ＥＳ細胞をピペットマン（P1000）で懸濁する。

３）1.5 ml eppen tube に移す。

４）Protanase Kを 5 ul 加え、50ﾟCで一晩インキュベートする。
　　注）この時点で室温保存可能。

５）400 ul PhOH/Ch/Isoを加え、１時間程度穏やかに混和。

６）15000 rpm, 3 min 遠心する。

７）上清を新しいチューブに移し、冷エタノール1 ml 加える。エッペンを何度も反転させて、よくよく十分に混和する。冷凍庫へ。ここで保存可能。

８）１時間後、15000 rpm, 5 min 遠心。

９）上清をデカントで除き、70% EtOH 1 ml 入れる。15000 rpm, 5 min 遠心。

１０）上清をデカントで除き、15000 rpm, 5 min 遠心。

１１）チューブの底に残った液をピペットマンＰ２００で除く。

１２）乾燥させる。自然風乾１０分から１５分。完全乾燥厳禁。

１３）水とバッファーと制限酵素（１チューブあたり制限酵素４ulで、総量３０ul）をあらかじめ混和しておいた物を加える。ピペッティング不要。１２ー２４時間、３７度インキュベートする。反応液の蒸発を防ぐため、ブロック型のインキュベーターではなく、大腸菌プレートをインキュベートする保温器を使用する。ここで冷凍保存可能。

１４）すべての番号がそろってからサザンを行う。これは番号間違いを防ぐため。サザンには半量使用すれば十分。