サザンブロット

（試薬）
0.25 M HCl（毎回調合する）
ｃｏｎｃＨＣｌを２４ｍｌを１０００ｍｌにする。

0.4 M NaOH（毎回調合する）
ＮａＯＨ１６ｇを１０００ｍｌｍＱに溶かす。

溶液２Ａ（冷蔵保存）
２Ｍ　ｔｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７・４） ５０ｍｌ
０・５Ｍ　ＥＤＴＡ ４０ｍｌ
５Ｍ　ＮａＣｌ ４００ｍｌ
Ｘ５０　デンハルト液 ４００ｍｌ
ｍＱ １１０ｍｌ

Ｘ５０　デンハルト液（凍結保存）
ＢＳＡ １０ｇ
Ｆｉｃｏｌ １０ｇ
ＰＶＰ １０ｇ
ｍＱで１０００ｍｌにする。

（方法）
１）ゲノムDNAを適当な酵素で消化する。Hind III, Sma I, Xba I はゲノムDNAを切断しにくいので、用いないようにする。スクリーニングに用いる制限酵素は、できればEcoRIかBamHIを使用する。どうしてもその二つが使えない場合はH buffer系の制限酵素で、できるだけポピュラーなものを選択する。反応は３０ ulくらいのスケールでおこない、制限酵素は４ ul (50U)も入っていれば十分（もう少し減らせられる）。O/Nで切断する（大腸菌などを飼う３７度のインキュベーター内で反応を行う）。

２）１５μｌサンプル（２４穴サンプルの半分量）を朝から夜までかけてゆっくりと電気泳動する。

３）紫外線を照射し、写真をとる。ゲルのとなりに物差しを置き、あとで大きさを特定できるようにしておく。ゲルをトリミングする。

４）ゲルを０・２５ＭのＨＣｌ、４００ｍｌ 中で１５分間振盪する。この操作によりDNAが小断片化し、メンブレンに転写されやすくなる。15分以上は絶対にやらない。

５）ゲルをMQ 水で数回すすぐ。

６）ゲルの裏表を逆にして０・４ＭのＮａＯＨ でトランスファーする。トランスファーの方法は他の教科書参照。メンブレンはハイボンドＮプラス（アルカリブロット用のメンブレンであれば他のモノでも可能）を使用する。トランスファーはO/N。

７）6X SSCで洗い、１５分間乾燥させ、ハイブリに供する。時間に余裕のあるときはハイブリの前に１時間、８０度真空処理を行う。若干シグナル強度があがる。

８）溶液１Ａ（２Ａを１／２希釈）、０・２％ＳＤＳ、０・１％　ＮａＰＰｉ、１５０μｇ／ｍｌ ｓｓＤＮＡ、でプレハイ。

９）６０度振盪、５時間以上。

１０）熱変性させたベクター外側プローブ（10ng/ml）を加える。ベクターの作製方法はメガプライム（あましゃむ）等のキットを参照。

１１）６０度振盪、１６時間以上４８時間まで。

１２）０・２ｘＳＳＣ，０・１％ＳＤＳ溶液で洗う。６０度振盪。

１３）カウントが下がってきたら（メンブレン１枚で、１０００から３０００カウントくらいが目安）キムタオルを軽く押しつけて水気を取り去り、サランラップで包む。メンブレンの乾燥は厳禁。リハイブリが出来なくなる。

１４）ＢＡＳ２０００、もしくはオートラジオグラフィーのフィルムで感光させる。ＢＡＳ２０００は便利であるが、時折弱めのシグナルが落ちることもあるので、フィルムでの感光も同時に行う。

１５）メンブレンをアルカリ処理（0.4 M NaOH で１時間くらい、６０度振盪）を行って、プローブをはがしとり、プレハイ後、ベクター内側（ネオなど）のプローブでリプロービング。以下は同じ。