ＥＳ細胞の染色体数の解析

　相同組換えをおこさせたＥＳ細胞の染色体数の解析を行う。ただし、多くの細胞がとれている場合や、インジェクションが自由にどんどん行える状況であるならこの作業は必須ではない。一般的には染色体数の変動はＥＳクローン内では頻繁に起こっていると思われるが、元のＥＳ細胞の出所が確かであればあまり気にすることはない。ただし、手間はさほどかからないので何かの機会に細胞をおこしたついでに解析するのが良いと思われる。

（試薬）
＊コルセミド 10 mg/ml (GIBCO No. 120-5210-AD)
＊Hypotonic solution
0.5g KCl in 100 ml DW
＊カルノア固定液
MeOH : AcOH = 3 : 1

（方法）
１）コンフルエント少し前の細胞にコルセミドを最終濃度 100 ng/ml となるように添加し、５時間以上培養する。

２）顕鏡して中期の丸まった細胞が多数あることを確認する。

３）ピペッティングにより細胞を培養皿底面より遊離させる。

４）培養液をチューブに集め、1000 rpm, 5 min 遠心する。

５）上清を除き、チューブ底面をたたいて細胞をほぐし、低張液を 5 ml 加え、37ﾟC, 15 min インキュベートする。

６）1000 rpm, 5 min 遠心する。

７）上清を除き、少量の低張液に細胞を懸濁して、固定液を 5 ml 加える。

８）氷上に１０分間静置する。

９）1000 rpm, 5 min 遠心する。

１０）上清を除き、少量の固定液に細胞を懸濁して、その一滴をスライドグラス上に落とす。

１１）スライドグラスをバーナーの火であぶって、乾燥させる。

１２）顕鏡して染色体を観察する。正常なら４０本の染色体がある。