コンピテントcell作り

　＜ １日目 ＞　　　　　― 夕方にやること ―
　　NZCYM培地（丸プレート）にDH5αをまき、37℃で培養する。O/N

　＜ ２日目 ＞
　　朝一番にプレートを4℃に移しておく。
　　　　↓
　　夕方、プレートからシングルコロニーを10個ぐらい取り、

　　500mlフラスコで37℃振とう培養する。O/N　（培地はSOB 約100ml）

　＜ ３日目 ＞　　　　　― 午前中から作業を始めること ―
　　O.D. check（O.D. 600、blankはSOB）

　　　★セルの中でSOBで３倍希釈してはかる。セルは長い方を使う。

　　　この時吸光度は 1.　　　になる値をとる
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　　吸光度が0.2〜0.3の範囲になるように2Lフラスコ内で希釈
　　（SOBで希釈する。上限は約200ml）
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　　室温にてshaker上で培養　　2hrぐらいでO.D. checkをする
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　　吸光度0.6ぐらいになったら、50mlチューブ４本に分注して、氷上にて10min
　　　この間にTBも一緒に氷上で冷やしておく。遠心は0℃にset
　　　最後に分注するエッペン・箱はケースごと-20℃で冷やしておく。
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　　遠心　0℃　2500rpm　10min　（これで不十分な時は 2800rpm　3min）
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　　上清を捨てて（コルベンに捨てて後でA.C.）、TBをディスポの10mlピペットを用いて、

　　まず２本のチューブに各10ml入れる
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　　サスペンドしたら、目分量で約33mlになるようTBを入れる
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　　氷上で10min冷却
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　　遠心　0℃　2800rpm　10min
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　　上清を捨てて＊16mlずつTBを入れサスペンド
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　　＊1.2ml/チューブのDMSOを加え、氷上にて10min　（この間にLN2を準備しておく）
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　　P-1000のピペットマンを使って、冷やしておいたエッペンに100μlずつ分注し、LN2へ
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　　箱に入れて-80℃保存

　　　★最後の分注の量や＊の量は場合により変更

コンピテントcellへのtransformation　（titer check）

　＜ １日目 ＞　　　　　― 午後から作業をすること ―
　　プラスミド（pBS�� KS(+)；1μg/μl）を0.01ng/μl、0.001ng/μl、0.0001ng/μlに
　　TE8で希釈する
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　　コンピテントcell入りエッペン３本を氷上でとかす。
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　　1〜20μlのプラスミドの溶液をコンピテントcellにそれぞれ加え、軽く混ぜる
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（氷上で作業をすること）
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　　氷上にて30min
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　　37℃のwater bathにて2min
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　　氷上に戻し、（2〜 ）5min
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　　900μlのSOCを加えて、37℃のwater bathにて60min
　　　この間にLB（Amp.入り）プレートをクリーンベンチで乾燥させておく
　　　　※あまり乾燥させすぎないように注意
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　　遠心　　室温　2600rpm　5min
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　　上清を除去して（コルベンに捨てて、後でA.C.）、100μlのSOCを加え、サスペンドする
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　　プレート（LB Amp.入り）に塗布して、37℃　O/N　（〜17hr）

　＜ ２日目 ＞
　　朝、インキュベーターからプレートを出し、コロニーの数を数える
　　（朝、時間がとれない時は4℃に移しておく）
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　　プラスミド1μgあたりの個数を算出する